جدول ‏۳‑۵ مواد مورد نیاز PCR 75
جدول ‏۳‑۶ مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده ۷۶
جدول ‏۳‑۷ برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD 76

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

جدول ‏۳‑۸ برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای ۱۶S rDNA 77
جدول ‏۳‑۹ مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای۱۶S rDNA 78
جدول‏۳‑۱۰ ۱۶S rDNA primer 78
جدول ‏۴‑۱بررسی میزان کوتین ۸۲
جدول ‏۴‑۲ بررسی میزان کوتین در خیارسبز ۸۳
جدول ‏۴‑۳ بررسی میزان کوتین در سیب زرد ۸۴
جدول ‏۴‑۴ بررسی میزان کوتین در سیب قرمز ۸۵
جدول ‏۴‑۵ تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه­ ها ۸۵
جدول‏۴‑۶ مقایسه میانگین میوه­ ها به روش دانکن در سطح احتمال ۱% برای صفت وزن کوتین نهایی ۸۶
جدول ‏۴‑۷ فعالیت کوتینازی ۶ نمونه ۸۸
جدول ‏۴‑۸ نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه­ها ۸۹
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل ‏۲‑۱ ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی ۵۱۰۰۰ برابر ۹
‏۲‑۲ مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید ۱۰
شکل ‏۲‑۳ نمایش شماتیکی از کوتیکول ۱۱
شکل ‏۲‑۴ a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی­های کوتین میوه گوجه­ فرنگی با میکروسکوپ الکترونی ۱۱
شکل ‏۲‑۵ a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز ۱۶
شکل ‏۲‑۶ هیدرولاز آلفا و بتا ۲۰
شکل ‏۲‑۷ ساختار کوتیناز ۲۱
شکل ‏۲‑۸ توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز ۲۸
شکل‏۲‑۹ مکانیسم عمل کوتیناز ۴۰
‏۲‑۱۰ گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41
شکل ‏۲‑۱۱نمودار دما و pH 41
شکل ‏۲‑۱۲ دسته­بندی نشانگرهای ژنتیکی ۴۴
شکل ‏۳‑۱ تهیه ژل آگارز ۶۸
شکل ‏۴‑۱مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه­ فرنگی ۸۱
شکل ‏۴‑۲ مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز ۸۲
شکل ‏۴‑۳ مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد ۸۳
شکل ‏۴‑۴ مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز ۸۴
شکل ‏۴‑۵ مقایسه میزان کوتین ۸۶
شکل ‏۴‑۶ میزان فعالیت سویه­ها ۸۸
شکل ‏۴‑۷ دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای ۹ پرایمر RAPD با روش UPGMA 90
شکل ‏۴‑۸ پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD 91
شکل ‏۴‑۹پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD 92
شکل ‏۴‑۱۰ ژل الکتروفورز افقی با آگارز ۱% با بهره گرفتن از پرایمرها ۹۳
شکل ‏۴‑۱۱ژل الکتروفورز با آگارز ۱% با پرایمرهای ۱۶S rDNA 94
فصل اول
معرفی
مقدمه
استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم­ها مستلزم ترشح آنزیم­ های هیدرولازی است که مهم­ترین آنها کوتیناز می­باشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی­استرهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­ کند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [۱]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب می­باشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [۲]. اصطلاح کوتین از کوتوس^[۱] گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف ماده­ای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی می­ کنند مانند چمن­دریا^[۲]، زئوسترا­ مارینا^[۳] دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیه­ی گیاهان یافت می­ شود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی­اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند[۳]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماری­زا ایفا می­ کند [۴] و تجزیه­ی آنزیمی آن یکی از اولین گام­ها در فرایند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایه­ی محافظ چربی­دوست است که برگ­ها، ساقه­ها و میوه­ ها را می­پوشاند. بر روی کوتیکول لایه­ای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه می­ شود در برابر عوامل بیماری­زا و آفات نیز از گیاه حفاظت می­ کند. استفاده از آنزیم کوتیناز باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده و همچنین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی زدایی به کار رفته است. تجزیه­ی پلاستیک­ها از قبیل پلی­استرهای مصنوعی، محصولات محلول در آب با بهره گرفتن از کوتیناز بدست آمده است.
اهمیت و ضرورت تحقیق
با توجه به ویژگی ها خاص آنزیم کوتیناز و کاربردهای ان در صنعت و بیوتکنولوژی و نیز چشم انداز روشن در فرایند تجزیه پلاستیک و الاینده های پلی استری موجود در طبیعت، یافتن انزیمی با شرایط مطلوب تر همواره مورد توجه بوده است. آنزیم­ های کوتیناز در باکتری­ ها و قارچ­ها مطالعه شده ­اند اما آنزیم های کوتیناز گونه های باکتریایی تا کنون به میزان کمتری مورد بررسی قرار گرفته اند.
امروزه یافتن آنزیم­هایی با خصوصیات جدید و ویژگی­های مطلوب­تر که از نظر صنعتی و پزشکی اهمیت دارند یکی از زمینه های مهم پژوهشی در علوم بیوتکنولوژی می باشد. یکی از این آنزیم­ های مهم آنزیم کوتیناز می­باشد که یک آنزیم هیدرولازی و ترشحی بوده و کوتین را تجزیه می­ کند. انزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها بوده و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. آنزیم کوتیناز اسیدهای چرب کوتین را با هیدرولیز باندهای استری آزاد می­ کنند. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم ها مستلزم ترشح آنزیم های هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر می تواند وارد سلول شده و باعث تولید آنزیم های هیدرولازی شود، اما یک احتمال در این زمینه این است که میکروارگانیسم­ها یک سطح پایه­ای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح می­ کنند و سپس با عملکرد این آنزیم­ها بر روی مواد پلیمری، این مواد هیدرولیز شده و محصولات هیدرولیز شده وارد سلول شده و سنتز آنزیم­ها را القا می کنند .
کوتیناز یک آنزیم چند منظوره است و چندین مشخصه جالب دارد که می تواند در فرایندهای صنعتی استفاده شود. از مهم­ترین شاخصه­های این آنزیم توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی استرهای کوچک می­باشد.