زمان

تکرار

Initial denaturation

95

5 دقیقه

1 سیکل

Denaturation

95

45 ثانیه

30سیکل

Annealing

60

45 ثانیه

Extension

72

45 ثانیه

Final extension

72

10 دقیقه

1 سیکل

3-8-6-روش تهیه­ ژل آگارز و انجام الکتروفورز
به منظور بررسی صحت قطعات محصولات PCR، از روش الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز استفاده گردید.
برای ساخت ژل 7/1% آگارز،93/0 گرم پودر آگارز در 55 میلی­لیتر بافرTAE 1x [66] در ارلن حل شد و به خوبی در مایکروویو حرارت داده شد تا محلولی کاملاً شفاف به دست آید. محلول ژلی تهیه شده در سینی ژل که دارای شانه مناسب بوده، ریخته شد و به مدت 20 تا 30 دقیقه به حالت سکون قرار داده شد تا ژل کاملاً بسته شود. سپس با احتیاط به گونه ­ای که چاهک­های ژل آسیب نبیند، شانه از ژل خارج گردید. سپس به همه نمونه­ها به میزان 2 میکرولیتر مایع رنگ­کننده­ Loading Dye افزوده شد. بعد از قرار گیری ژل در تانک پر از بافر TAE، 10 میکرولیتر از هر نمونه و 1 میکرولیتر Ladder به چاهک­ها افزوده و دستگاه الکتروفورز بر روی ولتاژV 95 قرار داده شد، پس از گذشت حدوداً 45 دقیقه، ژل به مدت 15 الی 20 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و نهایتاً پس از شستشو با آب مقطر درون دستگاه ثبت ژل گذاشته شد. عکس مورد نظر در کامپیوتر مشاهده و نهایتاً تصویر ژل ذخیره شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

3-8-7- طرز تهیه­ محلول­ها
1- بافر50x TAE
در ابتدا، میزان 242گرم پودر Tris-Base در 500 میلی لیتر آب دیونیزه حل شد. سپس 100 میلی لیتر محلول EDTA 0.5M با PH=8 و پس از آن 57/1 میلی لیتر اسیداستیک اشباع شده به آن افزوده شد. در نهایت حجم محلول با آب دیونیزه به 1000میلی لیتر رسید و در دمای اتاق نگهداری شد.
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml)
لازم به ذکر است که اتیدیوم بروماید ترکیبی بسیار خطرناک و سرطان­زا می­باشد، لذا در هنگام کار با اتیدیوم بروماید رعایت اصول ایمنی ضروری است. به سبب خاصیت فلورسانس اتیدیوم این ماده و ترکیب آن با بازهای داخل مولکول­های DNA، شدت نور حاصله از اینترکاله شدن اتیدیوم بروماید، باندها قابل رویت و توسط دستگاه ثبت ژلذخیره می­شوند. جهت تهیه­ محلول اتیدیوم بروماید به ازای هر لیتر آب مقطر، 50 میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید.
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیره­ای پلیمرازپیوسته[67]
برای بررسی و مقایسه­ میزان بیان ژن Kdm5d در نمونه­های بافت بیضه­ی موش­های بالغ، از واکنش زنجیره­ای پلیمراز پیوسته استفاده شد. در روش RT-PCR، بررسی بیان ژن به صورت کیفی انجام شد و حضور یا عدم حضور باندها و تا حدی شدت باندها نشان دهنده تغییرات بیان ژن بود. اما با روش Real-Time PCR، بررسی این تغییرات به صورت کمی انجام شد. در سال 1996 شرکت ABI تکنيک Real-time PCR را به صورت تجاري معرفي کرد و تا به امروز اين روش کمي، صحيح­ترين و حساس­ترين روش براي آشکارسازي و کمي­سازي اسيدهاي نوکلئيک به شمار مي­رود. اختصاصي بودن و حساسيت بالاي آن همراه با آشکارسازي مستقيم قطعات هدف، با بهره گرفتن از پرايمرها و پروب­هاي نشاندار شده با مواد فلورسنت و يا رنگ­هاي فلورسنت، مشکلاتي از قبيل ژل الکتروفورز، انتقال به غشا، دورگه­سازي[68] پروب­هاي راديواکتيو و محدوديت­هاي فيلم به عنوان آشکارساز را برطرف ساخت.
Real-time PCR از مولکول­هاي گزارشگر فلورسنت براي نمايش محصولات تکثير شده در طول هر سيکل واکنش PCR استفاده مي­کند. اين تکنيک امکان آشکارسازي محصول PCR در طول فاز لگاريتمي واکنش و همچنين ترکيب مرحله تکثير و آشکارسازي در يک مرحله را فراهم ساخته و نيازي به بررسي پس از PCR، مانند ژل الکتروفورز نيست. مقدار فلورسانس منتشر شده مستقيما به مقدار محصول توليد شده در هر سيکل PCR نسبت داده مي­شود، بنابراين مي­تواند به عنوان يک سنجش کمي از واکنش PCR به کار رود. محصولات PCR را مي­توان با بهره گرفتن از رنگ­هاي فلورسانس که به DNA دو رشته­اي متصل مي­شوند، يا با بهره گرفتن از پروب­هاي نشان­دار شده با مواد فلورسانس ويژه، مورد سنجش قرار داد.
3-8-8-1-روش Ct مقايسه­اي براي کمي­سازي نسبي
در اين روش، به جاي منحني استاندارد از يک فرمول رياضي استفاده مي­شود. مقدار هدف نرمال شده نسبت به يک کنترل دروني و نسبت به يک کاليبراتور با بهره گرفتن از فرمول زير محاسبه مي­شود: 2-ΔΔCt
هنگام استفاده از اين متد، مي­توان با کمک داده­هاي حاصل در طول آزمايش PCR، يعني مقادير Ct، آنها را مستقيما نسبت به يک مرجع دروني نرمال کرد و ديگر نيازي به تهيه منحني استاندارد براي ژن هدف و کنترل دروني در تمام نمونه­هاي آزمايشي نيست. اين موضوع زماني مفيد است که يک مقدار محدود از RNA در اختيار دارد يا زماني که مي­خواهد پردازش گسترده­اي از تعداد زيادي نمونه انجام دهد.
به منظور ارزيابي کمّی بيان رونوشت Kdm5d، تکنيک Real-time -PCR با بهره گرفتن از دستگاه Applied Biosystems 7500 و پرايمر Gapdh به عنوان کنترل داخلي مورد استفاده قرار‌گرفت.مواد لازم و چرخه­هاي دمايي به ترتيب در جدول (3-9) و (3-10) ذکر شده ‌است. لازم بذکر است که cDNA ساخته شده در مرحله 2-8-3 مورد استفاده قرارگرفت.
روش کار:
برای انجام Real Time-PCR، از پرایمر طراحی شده­ برای ژن Kdm5d و از پرایمر Gapdh به عنوان Housekeeping Gene استفاده شد. از cDNA­های سنتز شده از RNA مربوط به نمونه­های بافتی، به عنوان الگو در این واکنش استفاده شد. در این روش مواد یاد شده در جدول 3-5، به ازای هر واکنش داخل استریپ­های مخصوص Real-Time PCR ریخته شد. لازم به ذکر است که پس از افزودن ماده­ فلورسنت SYBR، ادامه کار در تاریکی انجام شد، زیرا این ماده در اثر برخورد با نور غیر فعال می­ شود و هم چنین تمام مراحل کار روی یخ انجام پذیرفت. پس از اتمام کار، استریپ­های حاوی نمونه به داخل دستگاهApplie Biosystem-7000 System ،Step One Plus System منتقل و پس از تنظیم برنامه دمایی ذکر شده در جدول 3-10، Real-Time PCR آغاز شد. اعداد نمایش داده شده در پایان کار به جای باندهای روی ژل، در روش RT-PCR تغییرات بیان ژن را نشان می دهد.
جدول(3-9): اجزاي لازم براي انجام واكنش Real-Time PCR

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...