- مرحله بعد، فاز جداسازی است که طی آن 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه کرده و به مدت 15 ثانیه با دست تکان میدهیم، سپسویال به مدت 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد.
- در ادامه، نمونه در دمای 4 درجه ی سانتیگراد، در دورg12000و به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سانتريفيوژ سبب تشکیل سه فاز می شود: فاز رویی که فاز آبی بوده و حاوی اسیدنوکلئیک میباشد، فاز میانی که فاز پروتئینی بوده و فاز پایینی که شامل کلروفرم و ترایزول بوده است.
- مرحله بعد تشکیل شدن رسوب RNA است که طی آن به آرامی فاز آبی محتوی RNA، برداشته شده و به یک ویال دیگر منتقل شد و هم حجم مقدار انتقال یافته، الکل ایزوپروپانول اضافه شد.
- ویال به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا عمل رسوب گذاری به خوبی انجام شود. پس از آن، ویال به مدت 10 دقیقه در دور g12000، در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد.
- پس از سانتریفیوژ، دو فاز تشکیل شد: محلول سوپرناتانت و رسوب RNA. محلول سوپرناتانت بالایی که حاوی ایزوپروپانول بود از سطح رسوب RNA کشيده شد. ویال حاوی رسوب RNA به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا خشک شود.
- در انتها 20 تا 50 میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز[59] به رسوب انتهایی ویال اضافه شد و رسوب در آب حل شد.
3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روي ژل آگارز
نانودراپ دستگاهی است که شدت نور را بصورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در حقیقت این دستگاه با بهره گرفتن از میزان جذب نور، تعیین غلظت می کند. برای بررسی خلوص RNAهای استخراج شده، میتوان از نسبت جذب نوری در طول موجهای 260 و 280 نانومتر (A260/A280) استفاده کرد. این نسبت باید در بهترین حالت بین 8/1 تا 2 باشد و نسبتهای کمتر نشان دهنده آلودگی به پروتئین میباشد.
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
روش کار:
ابتدا با 1 میکرولیتر آب مقطر دستگاه کالیبره شد. سپس 1 میکرولیتر RNAی استخراج شده روی لنز دستگاه قرارداده و جذب آن در طول موج 260 نانومتر خوانده شد. عدد خوانده شده توسط دستگاه، نشان دهنده غلظت RNA در یک میکرولیتر میباشد. با بهره گرفتن از این غلظت مقدار RNAای که برای سنتز cDNA باید مورد استفاده قرار گیرد، محاسبه شد. براساس غلظت خوانده شده، به منظور بررسي صحت استخراج RNA، از الکتروفورز 5/0 ميکروگرم RNA مورد نظر بر روي ژل آگارز 2/1% استفاده شد. براي اين منظور ابتدا 2/1 گرم پودر آگارز را در 100 ميليليتر بافر TAE با بهره گرفتن از حرارت حل نموده و پس از يکنواخت و همگن شدن، محلول را در ظرف مخصوص و با قرار دادن شانه در آن، ريخته و پس از بستن ژل، به آرامي شانه را از داخل ژل خارج کرده و ژل را درون تانکي که حاوي بافر TAE است قرار داده شد. سپس RNA استخراج شده با مقدار مناسبي از رنگ بارگذاري[60] مخلوط شد و در چاهک ژل آگارز 2/1% در بافر TAE تخليه شد و در ولتاژ 90 به مدت 40 دقيقه الکتروفورز گرديد. پس از آن، ژل به مدت 10 دقيقه در ظرف حاوي اتيديوم برومايد يک درصد رنگآميزي و سپس با آب مقطر شستشو داده شد و در زير نور ماوراءبنفش عکسبرداري انجام گرديد و روی ژل دو باند مشاهده شد که نشان دهنده صحتRNAهای استخراج شده بودند.
3-8-3- تیمار کردن نمونههای RNAی استخراج شده
تیمارکردن نمونه های RNAی استخراج شده با DNase I صورت می پذیرد که این کار جهت حذف آلودگی ژنومی به کار میرود. مقادیر بین 5/0تا 5 میکروگرم از RNA را میتوان تیمار کرد، ولی مقدار بهینه آن 1 میکروگرم است.
روش کار:
میزان 1 میکروگرم از محلول RNA(بر اساس جذب خوانده شده توسط نانودراپ) برداشته شده و به یک ویال منتقل شد، سپس با مواد ذکر شده در جدول زیر ترکیب می شود.
جدول(3-4): مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA
نام ماده
مقدار
RNA
1µg
DNase I
1µl
RNase inhibitor (20 u/µl)
1µl
DNase I buffer
2µl
سپس جمع موارد فوق از عدد 20 کم شد تا مقدار آب فاقد نوکلئاز که میبایست به این مواد اضافه میشد، به دست آید. پس از اضافه کردن مواد با یکدیگر، ویال به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد در دستگاه ترمومیکسر قرار داده شد تا عمل انکوباسیون انجام گیرد. پس از این زمان، 2 میکرولیتر محلولEDTA[61](25mM)، به ویال مذکور اضافه شد.EDTA یک کلات کننده فعالیت DNase I است و سبب متوقف کردن فعالیت این آنزیم می شود.پس از تیمارکردن، مجددا جذب RNA با نانودراپ خوانده شد. با کسب اطمینان از مناسب بودن غلظت RNA، از آن برای سنتز cDNA استفاده شد.
3-8-4- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA
با بهره گرفتن از فرایند نسخه برداری معکوس، رشته DNA از روی الگوی RNA ساخته می شود. محصول بدست آمده DNAی مکمل یاcDNA[62] نام دارد. در واقع واکنش رونوشت برداری معکوس، واکنشی است که طی آن، آنزیم[63]نسخه بردار معکوس، RNA را به cDNA تبدیل می کند.
از مقادیر 5/0 تا 2 میکروگرم میتوان برای سنتز cDNA استفاده کرد، ولی مقدار بهینه RNA برای سنتز cDNA از روی آن، 1میکروگرم است.
روش کار:
1- 1 میکروگرم از RNAی تیمار شده با IDNase برداشته شده و به داخل یک ویال 5/1 میلی لیتری ریخته شد. سپس 1میکرولیتر پرایمر هگزامر تصادفی[64]، به آن افزوده شد.
2- توسط آب فاقد نوکلئاز، حجم داخل هر ویال به 12 میلی لیتر رسید.
3- ویال به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا واکنش اتصال پرایمر به RNA به خوبی صورت پذیرد.سپس مجددا ویال به روی یخ منتقل شد.
4- سپس به ویال مواد زیر اضافه شد:
جدول(3-5): مواد مورد استفاده در سنتزcDNA
[چهارشنبه 1400-09-24] [ 11:48:00 ب.ظ ]
|