۲/۳۰

۷/۴۹

۱۰/۰

۷۸۶

۴/۴۳

۵۲/۱

۶/۱

۳/۲۸

۱۱/۲

شکل۳-۱- نقشه منطقه ی مورد مطالعه
۳-۲- روش‌ها
۳-۲-۱- نمونه برداری
به منظور شناسایی و استخراج اسپور قارچ‌های میکوریزی همزیست با ریشه‌ی درخت زالزالک در منطقه مورد مطالعه در هر رویشگاه و طی اردیبهشت ماه در سال ۱۳۹۲ تعداد درختان سالم و شاداب با پراکنش مناسب در رویشگاه آبدانان و ایلام به صورت تصادفی، تعیین شد. در قسمت سایه انداز درخت، یک نمونه‌ی ترکیبی از خاک به همراه ریشه از عمق ۳۰-۰ سانتی‌متری (صدروی، ۱۳۸۵) تهیه گردید. همچنین عوامل فیزیوگرافی و مشخصه‌ های درخت شامل قطر و ارتفاع یادداشت گردید. جهت برداشت شیب منطقه و ارتفاع درخت از شیب سنج سونتو، جهت جغرافیایی و ارتفاع از سطح دریا از GPS استفاده گردید. نمونه‌های خاک جهت استخراج و شناسایی قارچ‌های همزیست، اندازه‌گیری فراوانی اسپور قارچ‌ها، درصد کلونزاسیون و نیز اندازه‌گیری عناصر غذایی نیتروژن، پتاسیم، فسفر، اسیدیته، شوری و بافت (درصد شن، سیلت و روش) به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه‌های خاک در هوای آزاد خشک شده و سپس از آن‌ ها، جهت آنالیز عناصر، جداسازی و تعیین فراوانی اسپورها و اینوکلوم جهت تلقیح گیاه تله استفاده گردید.
۳-۲-۲- جداسازی اسپورها از خاک
به منظور استخراج قارچ‌ها از روش الک مرطوب و سانتریفیوژ کردن با ساکاروز استفاده شد Manimegalai et al., ۲۰۱۱)). به این منظور ۱۰۰ گرم خاک خشک را در یک لیتر آب حل کرده تا به حالت سوسپانسیون درآید. سپس ۱۰ ثانیه صبر کرده تا ذرات شن و خاک رسوب کرده و از سری الک‌های ۲۵، ۸۰ و ۴۰۰ مش را که به ترتیب روی هم قرار گرفته‌اند، عبور داده شد. ذرات درشت، مواد آلی و ریشه‌ها روی الک ۲۵ مش و ذرات خاک، اسپورهای بزرگ در پشت الک ۸۰ مش جمع‌ آوری شدند. این مواد در پتری نگهداری شدند تا بعداً مورد مطالعه قرار گیرند. در پشت الک۴۰۰ مش ذرات ریز خاک و اسپور قارچ‌های میکوریزی آربوسکولار جمع می‌شوند. این مواد در داخل فالکون مخصوص سانتریفیوژ (۵۰ میلی لیتر) ریخته و در مرحله اول به مدت ۵
دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. مایه رویی را برداشته و در یک ظرف جداگانه نگهداری شده و مجدداً محلول ساکاروز ۵۵ درصد (۵۵ گرم شکر در ۱۰۰ میلی لیتر آب) را به لوله های سانتریفیوژ اضافه کرده و ته نشین موجود را در محلول ساکاروز، به حالت سوسپانسیون درآورده و این بار به مدت ۲ دقیقه در ۲۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ می‌شود. محلول رویی را به همراه مایع قبلی که از مرحله اول سانتریفیوژ به دست آمده بود، از کاغذ صافی مدرج عبور داده تا اسپورها پشت آن جمع شده و فراوانی آن‌ ها تعیین شود.
۳-۲-۳-کشت تله‌ای جهت تکثیر قارچ‌ها
کشت تله‌ای به منظور دست یابی به تعداد زیادی اسپور سالم، جهت شناسایی ضروری است. در این تحقیق از گیاه ذرت جهت انجام کشت تله‌ای استفاده شد (کریمان و همکاران، ۲۰۰۵). به این منظور ۱۰۰ گرم از خاک هر نمونه به همراه قطعات ریشه‌ای برداشته و با محیط پایه (۲:۱ خاک استریل، شن استریل) در گلدان‌های دو کیلویی مخلوط شد. سپس چهار عدد بذر ضدعفونی شده‌ی ذرت در هر گلدان کاشته شد. گلدان‌ها به مدت ۵ ماه در شرایط گلخانه‌ای در دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام نگه‌داری شد. گلدان‌ها سه بار در هفته آبیاری شدند و در پایان دوره نیز به مدت دو هفته آبیاری قطع شد. بعد از پایان دوره (۵ ماه)، گیاه را از سطح خاک بریده و از خاک گلدان جهت استخراج و شناسایی اسپورها استفاده گردید.
۳-۲-۴-رنگ‌آمیزی ریشه‌ها جهت بررسی همزیستی
جهت رنگ‌آمیزی ریشه‌ها از روش Phillips و Hayman(1970) استفاده شد. برای این منظور ابتدا، ریشه‌ها را به خوبی شسته و در قطعات یک سانتی‌متری برش داده شد. سپس آن‌ ها را در محلول پتاس ۱۰ درصد و در دمای ۸۵ درجه سانتی‌گراد در بنماری در حال جوش قرار داده شد (مدت ۱ ساعت برای ریشه زالزالک و ۴۵ دقیقه برای ریشه ذرت)، تا کاملاً شفاف شوند. زمان و دمای شفاف‌سازی بستگی به تیپ ریشه‌ی مورد نظر دارد، به طوری که ریشه‌های ظریف در دما کمتر و یا زمان کوتاه‌تری شفاف سازی شدند. بعد از این مرحله، ریشه‌ها را با آب مقطر به خوبی شسته تا پتاس از آن‌ ها خارج شود. در صورتی که ریشه ظریف و فاقد رنگریزه باشد، نیازی به عمل سفید کردن با محلول آب اکسیژنه نیست، در غیر این صورت بایستی عمل سفید کردن روی ریشه‌ها صورت گیرد، ریشه‌ها را برای مدت ۵-۳ دقیقه در محلول اسید کلریدریک ۱ درصد قرار داده شد. از آنجایی که اسید جهت رنگ آمیزی ضروری است، از این مرحله به بعد نباید ریشه‌ها را با آب شستشو داد. برای رنگ آمیزی، ریشه‌ها را در محلول ۵% درصد آنیلین بلو در لاکتوفنل قرار داده و به مدت ۴۵ دقیقه در بنماری در حال جوش قرار گرفت. سپس نسبت به رنگ بری ریشه‌ها توسط لاکتوفنل اقدام شد. بعد این مرحله، ریشه‌ها رنگ خود را از دست داده و اندام‌های قارچی به رنگ آبی قابل مشاهده هستند. در نهایت با بهره گرفتن از ^[۳۶]PVLG یا لاکتوفنل، اسلاید دائمی تهیه گردید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۲-۵- تهیه‌ی اسلاید دائمی از اسپورها
برای تهیه اسلاید دائمی به محلول PVLG و معرف ملزر نیاز است (میرزایی و همکاران، ۱۳۹۰). به منظور تهیه‌ی محلول PVLG، مقدار ۷/۱ گرم پلی وینیل الکل را در ۱۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و به مدت یک ساعت در بن ماری در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد قرار گرفت تا محلول همگن ایجاد شود. سپس ۱۰ میلی لیتر اسید لاکتیک و ۱۰ میلی لیتر گلیسیرین به آن اضافه شد. در این حالت چنانچه محلول یکنواخت نبود، مدت زمان بیشتری در بن ماری قرار می‌گیرد. برای تهیه‌ی معرف ملزر، ۱۰۰ گرم کلرال هیدرات، ۵/۱ گرم ید، ۵ گرم یدید پتاسیم و ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر را با همزن مغناطیسی مخلوط می‌شوند. اسپورهایی که در پشت کاغذ صافی جمع شده، با سوزن برداشته و روی اسلایدهایی که حاوی دو قطره محلول PVLG و ملزر با فاصله است، منتقل می‌شوند. حدود ۵ دقیقه صبر کرده تا اسپورها در محیط تثبیت شوند، سپس روی هر یک از قطره‌های محلول، یک لامل با زاویه ۴۵ درجه گذاشته شد. تا اسپورها به خوبی تثبیت شده و حباب‌های هوا خارج شوند. سپس اطراف یکی از لامل‌ها را لاک گرفته و روی لامل دیگری به آرامی فشار آورده تا اسپورها شکسته و لایه‌های آن به خوبی دیده شوند و در نهایت اطراف آن را نیز لاک گرفته تا بتوان آن‌ ها را برای همیشه نگه داشت. اسلایدها در آزمایشگاه گروه جنگل دانشگاه ایلام نگهداری می‌گردند.
۳-۲-۶- شناسایی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار
شناسایی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار به صورت کلاسیک، بر اساس مورفولوژی اسپور است. برای شناسایی در حد جنس و خانواده، نحوه اتصال ریسه به اسپور کافی است؛ اما جهت شناسایی در حد گونه، لازم است که دیواره‌های اسپور نیز به خوبی مورد بررسی قرار گیرند. در این تحقیق از ویژگی‌های زیر برای شناسایی اسپور قارچ‌ها استفاده شد:
الف- قطر اسپور ب- رنگ اسپور و رنگ لایه‌های اسپور پ- تعداد لایه‌های اسپور ت- ضخامت لایه‌های اسپور ج- تعداد لایه‌های ریسه ج- ضخامت لایه‌های ریسه ح- شکل ریسه.
جهت بررسی و اندازه‌گیری ویژگی‌های فوق از میکروسکوپ نوری استفاده شد. عکس‌ها با بهره گرفتن از دوربین دیجیتال مدل Canon گرفته شد. شناسایی گونه‌ها با بهره گرفتن از کلید شناسایی Schenck و Perez (1989) و سایت اینترنتی http://invam.caf.wvu.edu انجام گردید.
۳-۲-۷- آنالیز نمونه‌های خاک
۳-۲-۷-۱-عوامل فیزیکی
بافت خاک: دانه بندی خاک به روش هیدرومتری و به این روش درصد شن، رس و سیلت به دست آمد.
وزن مخصوص ظاهری: به روش کلوخه اندازه‌گیری شد و بر حسب گرم بر سانتیمتر مربع به دست آمد.
ضخامت لاشبرگ: در محل برداشت نمونه‌های خاک، ضخامت لاشبرگ با بهره گرفتن از خط‌کش تا دقت سانتیمتر اندازه‌گیری شد.
۳-۲-۷-۲- عوامل شیمیایی
شوری خاک: با بهره گرفتن از دستگاه هدایت الکتریکی‌سنج و به کار گیری مخلوط ۱:۵ خاک و آب مقطر، بر حسب واحد دسی‌زیمنت بر متر به دست آمد.
pH خاک: به وسیله دستگاه pH متر و به کارگیری مخلوط۵/۲: ۱خاک و آب مقطر محاسبه شد.
پتاسیم قابل جذب: با دستگاه Flame photometry اندازه گیری شد و بر حسب ppm)) محاسبه گردید.
فسفر:به روش اولسن و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکت و براساس ppm)) محاسبه گردید.
ماده آلی: به روش Walkley-Black و بر اساس درصد، محاسبه گردید.
نیتروژن خاک: میزان نیتروژن خاک به روش کجدال اندازه گیری شد و بر حسب درصد برآورد شد.
۳-۲-۸- آنالیز داده‌ها
جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم افزار SPSS.16 استفاده شد. بعد از بررسی نرمال بودن داده‌ها توسط آزمون‌های کولموگراف اسمیرنوف ، با بهره گرفتن از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون دانکن فراوانی اسپورها در جهت‌های مختلف مقایسه گردید. به منظور مقایسه فراوانی اسپورها در دو رویشگاه مورد مطالعه از آنالیز تی غیرجفتی استفاده شد و از آنالیز پیرسون جهت بررسی همبستگی بین عوامل محیطی و فراوانی اسپورها استفاده گردید.
فصل چهارم:
(نتایج)
۴- نتایج
۴-۱-رنگ‌آمیزی ریشه‌های آلوده به میکوریزی
رنگ آمیزی ریشه‌های زالزالک و ذرت با روش Philips و Hayman (1970) همراه با کمی تغییرات انجام گرفت. پس از رنگ آمیزی، ساختارهای میکوریزی به رنگ آبی در ارتباط با ریشه‌های گیاه به وضوح دیده شدند. شکل(۴-۱) و (۴-۲).
شکل۴-۱- ریشه‌های آلوده به میکوریزی در گیاه زالزالک با بزرگنمایی(۴۰×)
شکل۴-۲- ریشه‌های آلوده به میکوریزی در گیاه ذرت با بزرگنمایی(۴۰×)
۴-۲- شناسایی قارچ‌های میکوریزی آربوسکولار