در حالت ایده­آل طی هر چرخه،محصول PCR دو برابر شده و بازدهی واکنش برابر با ۲ و درصد تکثیر ۱۰۰ خواهد بود. در این حالت بر اساس فرمول فوق،شیب خط منحنی استاندارد ایجاد شده برابر با ۳۲/۳- خواهد بود.
درصد بازدهی تکثیر از طریق فرمول زیر محاسبه می­ شود:
%Efficiency = (E – ۱) × ۱۰۰
در عمل درصد بازدهی تکثیر نزدیک به ۱۰۰% و در محدوده ۱۰۵%-۹۰% است.
شکل (۱-۲۳) : منحنی استاندارد
.
۱-۵-۶- آنالیز داده‌های کمی^[۱۱۷]
به طور کلی دو روش آنالیز برای داده‌ها در دستگاه Real-time PCR وجود دارد که شامل:

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

روش ارزیابی (سنجش) مطلق^[۱۱۸]
روش ارزیابی (سنجش) نسبی^[۱۱۹]
پژوهشگران براساس نوع هدف و کاربرد آنالیز داده‌ها، روش آنالیز کمی مناسب را انتخاب می‌کنند.
در ارزیابی نسبی از چندین روش متفاوت استفاده می‌شود که عبارتنداز :
ارزیابی نسبی با بهره گرفتن از دو منحنی استاندارد
روش CtΔΔ
روش فافل
روش لین وسنت
روش مقایسه‌ای CtΔΔ
یکی از روش ارزیابی نسبی نمونه‌ها، روش مقایسه‌ای CtΔΔ است. این روش ظرفیت پذیری نمونه‌ها را بدون نیاز به منحنی استاندارد در زمان مشاهده سطوح بیان نسبت به کنترل مرجع افزایش می‌دهد. برای موثر بودن این روش بایستی دامنه دینامیکی ژن‌های هدف و مرجع یکسان و مشابه باشد. در این حالت تفاوت CtΔ (CtΔ= تفاوت بین دو Ct از دو واکنش تکثیری برای مقدار مشابهی از نمونه اولیه) با رقت نمونه الگو بررسی ­شود.
فصل دوم
مروری بر
متون گذشته
۲-۱- مطالعات پیرامون نسبت جنسی
-در یک مطالعه که توسط حسین‌زاده و همکاران (۲۰۰۷) بر روی سوابق زایمان مربوط به گله‌های گاو شیری نژاد هلشتاین از آوریل ۱۹۹۸ تا سپتامبر ۲۰۰۶ صورت گرفت،نسبت جنسی ثانویه ۴/۵۲ درصد گوساله نر و ۶/۴۷ درصد گوساله ماده بدست آمد. نتایج نشان داد که نسبت جنسی ثانویه در هر دو مورد تک قلو و دو قلوزایی به سمت جنس نر بیشتر بود[۳۲].
-در مطالعه دیگر کاندلر (۱۹۹۸)،منی جمع‌ آوری شده از گاو نر را به منظور تعیین درصد اسپرم‌های حاوی کروموزوم Y بررسی کرد.این مطالعه نشان داد که در انزال‌های مختلف یک گاو تفاوت معنی‌داری از میزان اسپرم‌های واجد کروموزوم Y وجود دارد[۶].
-کاندلر در مطالعه دیگری در (۲۰۰۲)،اثر فرکانس استحصال منی را روی اسپرم‌های گاوی بررسی کرد. نتایج این مطالعه نشان داد که بین برنامه استحصال منی (فواصل جمع‌ آوری منی) و درصد اسپرم‌های حاوی Y ارتباط وجود دارد[۷].
-دراسپا­نیا اثر روش Double swim up بر نسبت جنسی ا­سپرم مورد بحث قرار گرفت[۲۷].در ژاپن بهبود تولیدمثلی گاو در طول تنش گرمایی را بررسی کردند[۲۳] .همچنین درایتا­لیا و انگلستان اثرات این عامل محیطی روی تولید مثل گاو بحث شد[۳۵] .در برزیل و ایالت متحده آمریکا نیز روی جنین ها و مراحل رشد بلاستوسیتی آنها و رشد فولیکول ها تحت تنش گرمایی­کار شد[۳۶, ۱۹].همچنین در برزیل اهمیت ژنوتیپ اسپرم روی رشد جنین در زمان تنش گرمایی بررسی شد[۲] .در مورد بهبود شرایط در­هنگام تنش گرمایی در برخی کشورها از جمله ایران و مکزیک تحقیقاتی صورت گرفت[۱۸].گروهی نیز درترکیه روی دمای ناحیه رکتال­و ارتباط ژنتیک با تولید مثل گاوها بررسی کردند[۱۲].در مورد جنسیت ا­سپرم در ایالت متحده آمریکا بر روی نسبت جنسی گوسا­له ها با بررسی نسبت ا­سپرم های واجد کروموزوم Y در انزال گاو نر کار شد.
در کانادا با روش nested PCRAmelogeninاسپرم ها را تعیین جنسیت کردند[۱۰, ۸].
در زیر به اختصار برخی نتایج کارهای مذکور که در مطالعات این پروژه یاری کننده بوده،آورده شده­است:
تنش گرمایی باعث هیپرترمی و در درجات بالاتر مرگ جانور خواهد شد­ و کاهش غذای مصرفی ،کاهش شیر تولیدی،کاهش رشد­و عملکرد تولیدمثلی را در گاوها به همراه دارد[۲۳, ۲].کمیت و کیفیت اسپرم در نرو قدرت باروری در این شرایط کاهش می یابد[۱۸].دمای بالای ۳۹ درجه در منطقه رکتال و سرعت تنفس بالاتر از ۶۰ بار در دقیقه بازده شیر و باروری را تحت تأثیر قرار می دهد[۱۲, ۲]. کاهش نرخ حاملگی به مقدار ۱۲% به ازای هر ۵/۰درجه افزایش دمای رکتال وجود دارد[۳۵]. اسپرم­ها ممکن است بمیرند و یا سرعت حرکت آنها کاهش می یابد[۱۸]. رشد جنین نیز کند و سخت می شود[۱۸].فاصله رفتار فحلی^[۱۲۰]گاو ماده نیز کاهش می یابدو کیفیت اووسیت ها و ترشح هورمون جنسی زنانه کم می شود. (در تابستان:۴/۵ mount و در زمستان ۶/۸([۲۳, ۳۶, ۱۸].
تنش گرمایی باعث می شود که تعداد فولیکول های کوچک و متوسط نسبت به بزرگ ها و بالغ­ ها افزایش یابد و دامنه فولیکول­های توانمند کاهش یابد[۲۲, ۳۵, ۳۶]. اووسیت های جدا شده از گاو هلشتاین در تابستان در قیاس با آنها که در زمستان جدا کردند رشد کمتری داشت[۳۶, ۲۳].
با توجه به این مشکلات تدابیری امتحان و آزمایش شد:
-تأثیر استفاده از بیوتکنولوژی تولید مثلی در بالا بردن مقاومت گاوها به اثبات رسیده است. [۲۳, ۲]رشد فولیکول ها با بهره گرفتن از داروی خاص قابل تغییر است[۳۵, ۲]. کنترل هورمونی جنین های دهنده^[۱۲۱]روی تخمک­گذاری بسیار مؤثر است.
Artificial Inseminationیکی از راه­های مناسب برای کاهش نرخ ناباروری در نرهاست که با بهره گرفتن از منی­های^[۱۲۲] نگه­داری شده در محیط خنک انجام می گیرد. واز طریق تزریق هورمون ها مثل GnRH و پروستاگلاندین F2 تکمیل می شود[۳۵, ۲۳, ۱۹].مشکل توقف بارداری ناشی از تنش­گرمایی با انتقال جنین^[۱۲۳]و IVPتا حدی رفع می­ شود[۳۶, ۲] این روش­ها بازده بیشتری از AI دارند.
نژاد گاوها نیز اهمیت دارد. گاوهای Taurus taurusنسبت به گاوهای Taurus indicusکمتر قابلیت تطابق دمایی بدن خود را در شرایط تنش دارندو جنینهای آنها نیز رشد کمتری دارند[۲].
-مدیریت تغذیه داممثل استفاده از آنتی اکسیدان ها(ویتامین E ) و بهبود ژنتیکی آنها و ایجاد شرایط دمایی مناسب مثل رطوبت­و باد­ و سایه نیز می ­تواند بسیار در بازده تولید مثلی گاوها مؤثر باشد[۲۳, ۱۸].
۲-۲- مطالعات روی روش­های تعیین نسبت جنسی
برای ارزیابی درصد اسپرم های واحد کوروموزوم XوYدر مایع منی روش های مختلفی وجود دارد از آن جمله می‌توان به PCRمعمولی،ساترن بلات کمی،Real-Time PCR،الکتروفورزموئین و PCRاستفاده کرد .
-در آزمایشی که چکا و همکاران وی در سال ۲۰۰۲انجام دادند،از ژنی به نام آمیلوژنین^[۱۲۴] (ژن مربوط به پروتئینی که از ماتریکس خارج سلولی^[۱۲۵] توسط سلول های آمیلو پلاست در طول تکامل سلولی بنیادی دندان تولید می‌شود و در گاو اولین بار توسط شخصی به نام گیبسون (Gibson) توضیح داده شد،استفاده شد تا فراوانی کروموزوم های XوYاز طریق روش الکتروفورزوموئین^[۱۲۶] مورد سنجش قرار دهند.نتایج نشان داد به طور میانگین ،۷۹/۲+ـ۰۲/۵۰درصد از اسپرم ها حامل کوروموزوم Xبودند[۹].
-در بررسی دیگری کولی بولر و گلوان (Colley ,Buhr ,Golovan.) (2008) نسبت جنسی اسپرم گاوی را از طریق روشی به نام PCRمطالعه کردند و منی های جدا شده از نظر اسپرم XوYرا با منی های جدا نشده مقایسه کردند.آن ها دیدند که از هر۶ اسپرم ۲تای آن ها در واحد کروموزوم Xو۴تای آن ها در واحد کروموزوم Yمی‌باشند.(ژن آمیلوژنین در کروموزومXbp 63 از همین ژن در کروموزوم Yبزرگتر است. در کروموزوم Xطول آن bp239 است روش کلی کمکی آن­ها فلوسیتومتری و Real Time PCR بود.ژن های آن ها PLPوSRYو آمیلوژنین بود[۱۰].
-لوبن و همکاران او(Lobel et al) (1993) روی ۹۸نمونه اسپرم انسانی کار اردند و از ژن های ZFXوZFYبه این منظور استفاده کردند.و نتیجه این بود که درصد اسپرم های واحد کوروموزوم Yدر انزال ها از ۹/۴۱٪تا۷/۵۶٪متغیر بوده و ضریب تغییرات آن ۵/۶٪بود[۲۵].
-بوری و همکاران وی(۲۰۰۳) با بهره گرفتن از روش PCR نسبت قطعات X و Y را در اسپرماتوزوئید ها سنجیدند.(۱۰ گاو Holstein و ۵ گاو Rubia Gallegea ) میزان کروموزوم Y حدود از ۹/۴۶ % تا ۷/۵۲ % در اسپرم های هر انزال متفاوت بود[۲۷].
-کاندلر و همکاران وی(Chandler et al)(1998)از PCRاستفاده کردند تا اختلاف بین انزال هایگاو را بررسی کنند.در این رابطه از توالی اختصاصی کروموزوم (۱۳RY1)Yاستفاده شد .نتیجه تفاوت معنی دار گستره ۲۴٪تا۸۴٪در اسپرم های حاوی کروموزوم Yبود[۶].
-کاندلر و همکاران وی درسال ۲۰۰۲اثر فرکانس استحصال منی بر نسبت جنسی را نیز با بهره گرفتن از Conventional PCRبررسی کردند.آن ها از ژن SRYو ژن فاکتور FIX) IX)استفاده کردند.نتایج آن ها روی ژن الکتروفوز ۴٪دو باند bp151 و bp 122را به ترتیب برای SRYو FIX نشان دادو نسبت مشخص گردید.این نمونه ها در انزال های مختلف از یک گاو مقایسه شد[۷].
-کاندلر و همکاران او در سال۲۰۰۷نسبت جنسی گوساله ها را با بررسی نسبت جنسی اسپرم ها در ۳۶انزال از۸گاو Holsteinبررسی کردند.آن ها از ژن های FIXوSRYوGAPDHاستفاده کردند و مشاهدات آن­ها نشان داد که نسبت موالید با نسبت ژنتیک اسپرم­ها تطابق دارد[۸].
-پل و همکاران او (PAUL etal)(2003)از روش RT-PCRوConventional PCRبرای تعیین اسپرم های حاوی کروموزوم XوYدر گاو و خوک استفاده کردند.نتایج نشان داد که این درصد مستقیما مطابق درصدی است که نوزادان یا موالید در خوک داشتند.آن ها از ژن SRYوFIXاستفاده کردند[۳۲].
-پانچل و همکاران وی (Ponchel et al) (2003) از روش مشابه پل و همکاران وی استفاده کردند و امکان پایش محصول بعد از هر همانندسازی و در زمان جمع شدن و امکان استفاده از مقدار اندک DNA اولیه (الگو) را در استفاده از این روش اثبات کردند[۳۳].
-در سال (۲۰۰۴) جرج و همکاران آن (Joerg et al) با روش RT-PCR‌نسبت قطعه‌‌ای از ژن SRY‌را با ژن اتوزوم MSHR‌در منی گاو مقایسه کردند[۲۲].
-پاراتی و همکاران (Parati etal) در سال (۲۰۰۶) آزمایشی برای ایجاد یک روش خوب و اقتصادی برای سنجش مایع منی تعیین جنسیت شده انجام دادند. آنها از RT-PCR استفاده کردند[۳۱].
-پوگلیسی و همکاران (۲۰۰۶) (Puglisi etal) از روش پاراتی و همکاران آن استفاده کردند و نتایج را با روش فلوستیو متری مقایسه کردند[۳۴].
فصل سوم
مواد و روش­ها